Разработка и валидация таргетного метода секвенирования по Сэнгеру для молекулярной диагностики фенилкетонурии
Ключевые слова:
фенилкетонурия, гиперфенилаланинемия, секвенирование экзома, анализ мутаций ДНКАннотация
Введение. Фенилкетонурия (ФКУ) — аутосомно-рецессивное нарушение обмена фенилаланина, обусловленное патогенными вариантами гена PAH. Аллельная гетерогенность гена и необходимость дифференциальной диагностики форм гиперфенилаланинемии требуют молекулярного подтверждения. Секвенирование по Сэнгеру сохраняет значение как доступный и надёжный метод верификации вариантов и семейного анализа.
Цель исследования. Разработка и валидация унифицированного протокола ПЦР и секвенирования по Сэнгеру всех кодирующих экзонов PAH с расширенным покрытием экзон-интронных границ.
Материалы и методы. Разработана панель из 31 праймера для амплификации 13 экзонов PAH, включая перекрывающиеся ампликоны для экзона 13. Применены унифицированные условия ПЦР (60 °C). Валидация проведена на 5 образцах ДНК, включая семейное трио. Секвенирование выполнено на Applied Biosystems 3730xl.
Результаты. Разработанная панель праймеров обеспечила воспроизводимую и высокоспецифичную амплификацию всех целевых участков ожидаемого размера. Секвенирование продемонстрировало высокое качество хроматограмм и полное покрытие анализируемых фрагментов, включая перекрывающиеся регионы. В семейном трио у пробанда были выявлены два патогенных миссенс-варианта гена PAH в состоянии составной гетерозиготности: c.728G>A (p.Arg243Gln) в экзоне 7 и c.1238G>C (p.Arg413Pro) в экзоне 12. Семейный анализ показал, что вариант c.728G>A был унаследован от отца, а c.1238G>C — от матери. Дополнительно в отцовском аллеле была идентифицирована синонимичная замена c.735G>A.
Установленный генотип полностью соответствовал клиническому диагнозу классической ФКУ и подтвердил диагностическую пригодность разработанного подхода.
Выводы. Предложенный протокол является воспроизводимым, доступным и клинически информативным методом молекулярной диагностики ФКУ и может использоваться как самостоятельный инструмент и для подтверждения результатов других подходов.
Скачивания
Библиографические ссылки
Scriver, C. R. (2007). The PAH gene, phenylketonuria, and a paradigm shift. Human Mutation, 28(9), 831–845. https://doi.org/10.1002/humu.20526
Nulmans, I., Lequeue, S., Desmet, L., Neuckermans, J., & De Kock, J. (2025). Current state of the treatment landscape of phenylketonuria. Orphanet Journal of Rare Diseases, 20(1), 281. https://doi.org/10.1186/s13023-025-03840-y
Gundorova, P., Zinchenko, R. A., Kuznetsova, I. A., Bliznetz, E. A., Stepanova, A. A., & Polyakov, A. V. (2018). Molecular-genetic causes for the high frequency of phenylketonuria in the population from the North Caucasus. PLOS ONE, 13(8), e0201489. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0201489
Abkevich, V., Camp, N. J., Hensel, C. H., Neff, C. D., Russell, D. L., Hughes, D. C., & Cannon-Albright, L. (2003). Predisposition locus for major depression at chromosome 12q22–12q23.2. American Journal of Human Genetics, 73(6), 1271–1281. https://doi.org/10.1086/379978
Köseoğlu, S. Z. A., & Çelikel, S. (2020). The current information in nutrition therapy of phenylketonuria. Avrupa Bilim ve Teknoloji Dergisi, 18, 755–761. https://doi.org/10.31590/EJOSAT.693556
Brown, C. S., & Lichter-Konecki, U. (2016). Phenylketonuria (PKU): A problem solved? Molecular Genetics and Metabolism Reports, 6, 8–12. https://doi.org/10.1016/j.ymgmr.2015.12.004
Bélanger-Quintana, A., Burlina, A., Harding, C. O., & Muntau, A. C. (2011). Up to date knowledge on different treatment strategies for phenylketonuria. Molecular Genetics and Metabolism, 104, S19–S25. https://doi.org/10.1016/j.ymgme.2011.08.009
Burke, W., Tarini, B., Press, N. A., & Evans, J. P. (2011). Genetic screening. Epidemiologic Reviews, 33(1), 148–164. https://doi.org/10.1093/epirev/mxr008
Ramoser, G., Caferri, F., Radlinger, B., Brunner-Krainz, M., Herbst, S., Huemer, M., & Austrian IMD Registry Group. (2022). 100 years of inherited metabolic disorders in Austria—A national registry of minimal birth prevalence, diagnosis, and clinical outcome of inborn errors of metabolism in Austria between 1921 and 2021. Journal of Inherited Metabolic Disease, 45(2), 144–156. https://doi.org/10.1002/jimd.12442
Salama, N., Gamal, R., Zaki, O., Khalil, A., Obada, M., & El Gedawy, G. (2023). Determination of neopterin and biopterin in dried blood spot by tandem mass spectrometry in classic and atypical hyperphenylalaninemia. Egyptian Journal of Hospital Medicine, 90(1), 904–913. https://doi.org/10.21608/EJHM.2023.279962
Lo Bianco, M., Leonardi, R., Migliore, A., Moliteo, E., Sciacca, M., Rinella, S., & Polizzi, A. (2025). Sapropterin dihydrochloride responsiveness in phenylketonuria: A case series exploring gaps in comprehensive patient monitoring. Nutrients, 17(17), 2892. https://doi.org/10.3390/nu17172892
Hillert, A., Anikster, Y., Belanger-Quintana, A., Burlina, A., Burton, B. K., Carducci, C., & Blau, N. (2020). The genetic landscape and epidemiology of phenylketonuria. American Journal of Human Genetics, 107(2), 234–250. https://doi.org/10.1016/j.ajhg.2020.06.006
Zeng, B., Lu, Q., Chen, S., Guan, H., Xu, X., Zou, Y., & Yang, B. (2023). Screening and mutation analysis of phenylalanine hydroxylase deficiency in newborns from Jiangxi province. Frontiers in Genetics, 14, 1049816. https://doi.org/10.3389/fgene.2023.1049816
Costa, R. D., Galera, B. B., Rezende, B. C., Venâncio, A. C., & Galera, M. F. (2020). Identification of mutations in the PAH gene in PKU patients in the state of Mato Grosso. Revista Paulista de Pediatria, 38, e2018351. https://doi.org/10.1590/1984-0462/2020/38/2018351
Tolve, M., Artiola, C., Pasquali, A., Giovanniello, T., D’Amici, S., Angelon, A., & Carducci, C. (2018). Molecular analysis of PKU-associated PAH mutations. Methods and Protocols, 1(3), 30. https://doi.org/10.3390/mps1030030
Bernabeu, P., Lynott, D., & Connell, L. (2021). Preregistration: The interplay between linguistic and embodied systems in conceptual processing. https://doi.org/10.1136/archdischild-2017-313929
Shen, G., Li, W., Zhang, Y., & Chen, L. (2024). Next-generation sequencing based newborn screening and comparative analysis with MS/MS. BMC Pediatrics, 24(1), 230. https://doi.org/10.1186/s12887-024-04718-x
Liu, N., Kong, X. D., Zhao, D. H., Wu, Q. H., Li, X. L., Guo, H. F., & Shi, H. R. (2015). Prenatal diagnosis of Chinese families with phenylketonuria. Genetics and Molecular Research, 14(4), 14615–14628. https://doi.org/10.4238/2015.November.18.25
Jalali, H., Zamanfar, D., Amirzadegan, M., Ghadami, F., Mahdavi, M., & Mahdavi, M. R. (2024). Mutation analysis of PAH gene in phenylketonuria patients from the North of Iran: Identification of three novel pathogenic variants. International Journal of Preventive Medicine, 15, 22. https://doi.org/10.4103/ijpvm.ijpvm_50_23
Wang, Q., Duan, J., Zhao, X., & Qi, Z. (2025). The incidence rate and gene mutation characteristics of hyperphenylalaninemia in Yunnan Province, Southwest China. Orphanet Journal of Rare Diseases, 20(1), 606. https://doi.org/10.1186/s13023-025-04114-3
Lee, Y. W., Lee, D. H., Kim, N. D., Lee, S. T., Ahn, J. Y., Choi, T. Y., Lee, Y. K., Kim, S. H., Kim, J. W., & Ki, C. S. (2008). Mutation analysis of PAH gene and characterization of a recurrent deletion mutation in Korean patients with phenylketonuria. Experimental & Molecular Medicine, 40(5), 533–540. https://doi.org/10.3858/emm.2008.40.5.533
Berdimuratova, K. T., Amirgazin, A. O., Kuibagarov, M. A., Lutsay, V. B., Mukanov, K. K., & Shevtsov, A. B. (2020). Optimization of PCR purification using silica-coated magnetic beads. Eurasian Journal of Applied Biotechnology, 1. https://www.biotechlink.org/index.php/journal/article/view/20
Bercovich, D., Elimelech, A., Zlotogora, J., Korem, S., Yardeni, T., Gal, N., & Anikster, Y. (2008). Genotype–phenotype correlations analysis of mutations in the phenylalanine hydroxylase (PAH) gene. Journal of Human Genetics, 53(5), 407–418. https://doi.org/10.1007/s10038-008-0264-4
Liu, N., Huang, Q., Li, Q., Zhao, D., Li, X., Cui, L., & Kong, X. (2017). Spectrum of PAH gene variants among a population of Han Chinese patients with phenylketonuria from northern China. BMC Medical Genetics, 18(1), 108. https://doi.org/10.1186/s12881-017-0516-2
Vieira Neto, E., Laranjeira, F., Quelhas, D., Ribeiro, I., Seabra, A., Mineiro, N., & Ribeiro, M. G. (2018). Mutation analysis of the PAH gene in phenylketonuria patients from Rio de Janeiro, Southeast Brazil. Molecular Genetics & Genomic Medicine, 6(4), 575–591. https://doi.org/10.1002/mgg3.408
Shirzadeh, T., Saeidian, A. H., Bagherian, H., Salehpour, S., Setoodeh, A., Alaei, M. R., ... & Sharifi, F. V. (2018). Molecular genetics of a cohort of 635 cases of phenylketonuria in a consanguineous population. Journal of Inherited Metabolic Disease, 41(6), 1159–1167. https://doi.org/10.1007/s10545-018-0228-6
Jin, X., Yan, Y., Zhang, C., Tai, Y., An, L., Yu, X., & Ma, X. (2022). Identification of novel deep intronic PAH gene variants in patients diagnosed with phenylketonuria. Human Mutation, 43(1), 56–66. https://doi.org/10.1002/humu.24292
Rahimzadeh, A., Khosravi, T., Motallebi, F., Al Sudani, Z. M., Vaghefi, F., Kowsari, A., & Oladnabi, M. (2024). A rare combination of compound heterozygous mutations in the PAH gene in three unrelated consanguineous Iranian families with classical phenylketonuria. Advanced Biomedical Research, 13, 64. https://doi.org/10.4103/abr.abr_471_23
Wang, X., Wang, Y., Ma, D., Zhang, Z., Li, Y., Yang, P., & Jiang, T. (2021). Neonatal screening and genotype–phenotype correlation of hyperphenylalaninemia in the Chinese population. Orphanet Journal of Rare Diseases, 16(1), 214. https://doi.org/10.1186/s13023-021-01846-w
